基因细胞与Ⅰ型糖尿病

    摘要 目前ⅰ型糖尿病的基因治疗领域取得众多进展，如转入凋亡基因异种胰岛细胞 以阻断免疫反应，通过各种策略将内分泌细胞系、肝细胞及成纤维细胞等经基因工程构建成能 分泌成熟胰岛素的细胞，其分泌作用需受正常调控，本文对有关进展作以综述。     
    ⅰ型糖尿病由胰岛β细胞自身免疫破坏所致，常规治疗是定期注射胰岛素。然而血糖难 以达到功能良好的β细胞自然分泌胰岛素的控制状态，急性并发症（低血糖及酮症酸中毒）偶 尔发生，慢性并发症仍为威胁糖尿病患者的主要危险[ ]。为建立内源性胰岛素分泌系统，胰 腺或胰肾联合移植已做了尝试，但需长期免疫抑制治疗，亦有较高的失败率。从异体分离β细 胞移植也存在诸多缺陷，且胰腺供体有限。目前试图替代人β细胞，首先利用异种胰岛或β细胞系；其次是对非胰岛素的细胞必需具有下列特性：
    ①表达gk和glut ；
    ②低表达高亲和力的 已糖激酶（hk）；
    ③表达激素原转换酶pc 、pc ，能有效加工胰岛素原成胰岛素；
    ④能将胰岛 素释放到细胞外的分泌系统。然而仅β细胞具有所有这些特性，因而已探索对某些细胞进行改 造。
      细胞的基因工程构建 
     . 异种胰岛细胞胎猪胰岛移植用于ⅰ型糖尿病具有较好的疗效且取材便利，然而因排斥显著疗效难以持 久[ ]。fasl受体表达在免疫细胞表面，fas-l与fas受体相互作用可诱导免疫细胞凋亡，故该 作用在维持免疫系统稳态及免疫耐受中发挥重要作用。lau研究显示同时移植经基因工程处理 能表达fas配体（fasl）的肌纤维细胞，可明显延长移植胰岛细胞存活期。但半数以上的小鼠 仍在80天内移植物失效，部分由于肌纤维细胞停止表达fas-l\[ ]，如何使fas-l长期表达尚需 进一步研究。
     .  细胞株构建     
    β细胞类细胞系显然是一类较符合生理的胰岛替代物，经构建的细胞株可大量获得。在 转基因小鼠胰岛细胞中定向表达sv 0大t（sv 0 large t）抗原可导致胰岛素瘤，已作为细胞 株的来源[ ]。这引起细胞对葡萄糖刺激的胰岛素反应存在缺陷，表现为反应减弱或过强，可 能与葡萄糖感应器：葡萄糖磷酸化酶（gk）和葡萄糖转运体（glut ）的表达异常有关[]。同 时尽管未免疫隔离的细胞将被免疫系统杀灭，但这种永生型细胞移植于人体需要微包囊化。 
     .  神经内分泌细胞   
    早在 98 年有人曾对神经内分泌细胞株（一种分泌acth细胞株，att 0）作生物改造，用 病毒启动子调控人胰岛素cdna转录获得初步结果。在胰腺特异性启动子调控下gk基因可在att  0表达，用表达载体转染后则表现出葡萄糖刺激的胰岛素释放[6]。正常的葡萄糖感应不仅需 要表达glut ，而且需要类似于正常β细胞的gk/hk活性比值[7]。最近有学者将胰岛素原表达 载体直接导入nod小鼠的垂体间叶pomc分泌细胞，能大量分泌成熟胰岛素，而这些细胞不受针 对胰岛细胞的自身免疫破坏，将一定量的构建细胞移植于nod糖尿病小鼠，高血糖及糖尿病症 状完全恢复，与胰岛细胞自体移植相比，显示分泌活性更高，再血管化更明显[8]。  .  肝细胞     
经基因工程构建的外源型细胞株用于ⅰ型糖尿病存在各种障碍，已促使许多研究着眼于 内源性细胞。除胰岛细胞外肝细胞是含有葡萄糖感应器（glut 及gk）唯一的体细胞，许多肝 脏特异性基因受生理性葡萄糖调控，故作为ⅰ型糖尿病基因治疗的靶细胞尤为引人关注。然而 肝细胞不具备有葡萄糖控制胞吐作用的分泌颗粒，也无贮存分泌性蛋白的隔离区。当血糖升高 时，不会出现早相胰岛素分泌。肝细胞也不具有切除c肽所需的激素原转化酶（pc 和pc ）， 故不能加工胰岛素原分子[9]。因而，针对肝细胞作为分泌胰岛素细胞存在上述缺陷，有关研 究不断深入。valera在磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（pepck）基因调控区控制下，得到表达人胰 岛素原基因的转基因小鼠，从肝细胞分泌的胰岛素原具有生物活性，该动物呈现血糖正常且健 康善良好，经链脲佐菌素（stz）处理转基因小鼠后，胰岛素mrna水平较stz处理的非转基因的 对照鼠增加，且血中c肽增加，血糖水平下降达 0%[ 0]。     
    此外，肝肿瘤细胞亦可作为胰岛素表达载体转染的候选细胞，gros等将融合胰岛素基因 构建于哺乳细胞的表达载体，其中含有人胰岛素原基因（含有费林蛋白内切酶切点）及pepck 基因的启动子片段，再转染到大鼠肝肿瘤细胞，后经northern印迹、免疫组化及hplc分析显示 90%胰岛素原被加工成胰岛素。胰岛素分泌反应快速，经二丙基camp+地塞米松诱导 分钟，胰 岛素分泌量明显增加， 小时内增加 0倍，表现为内源性pepck基因表达受抑及葡萄糖摄取增加 [ ]。若同时将人glut 基因转染肝肿瘤细胞，胰岛素分泌可受葡萄糖浓度调控[ ]。 
     . 成纤维细胞及其它细胞     
    taniguchi用人胰岛素原cdna转染成纤维细胞（ltk细胞），人胰岛素原分泌量达9 ng/   小时/ 06细胞。这些细胞经半透膜（%琼脂糖胶）微囊化，体外研究显示 × 06微囊化的转 染细胞能稳定产生胰岛素原80余天（ 0 . ±. ng/ml/天），若种植于stz糖尿病小鼠腹腔内 ，血糖恢复正常达 0天[ ]。另外，将表达胰岛素原的质粒转染成肌细胞，约0%胰岛素原转 化为胰岛素，其分泌功能持续达 个月[ ]。kuzume用胰岛素原基因构建的腺病毒载体转染到  9 细胞，再植入胰腺全切的狗体内，与定期注射胰岛素组相比，血糖维持正常且生存期明显 延长，即使口服 g葡萄糖后血糖仍维持正常[ ]。 
      细胞因子     
    tgfβ 能降调许多免疫反应，故有学者将表达tgfβ 载体转染nod小鼠，tgfβ 水平较对 照组增加，迟发型超敏反应受抑制能保护具有自身免疫反应倾向的nod小鼠免于发生胰岛炎或 糖尿病，相反转入干扰素γ的nod小鼠早发糖尿病[ 6]。此外，血管内皮细胞生长因子（vegf ）与新生血管形成有关，观察显示在糖尿病nod小鼠的缺血部位vegf水平下降，以致干扰侧枝 循环形成，肌肉注射编码vegf的腺病毒载体，可使nod糖尿病小鼠的vegf的腺病毒载体，可使 nod糖尿病小鼠的vegf水平及新生血管形成作用恢复正常[ 7]。 
      表达载体     
    腺病毒载体较适合体内基因转导，其特点是产生的梯度高，能有效地把基因转导入静止 期细胞，遗传信息保持其独立可避免因插入性突变改变细胞基因型的危险。但可激发细胞免疫 ，甚至可针对导入基因[ 8]，同时转入基因表达时间有限，故不适宜ⅰ型糖尿病治疗。缺陷型 重组逆转录病毒载体导入细胞后具有自我更新的特性，可长期表达。但产生滴度较低，且细胞 需处在增殖期，否则前病毒dna不易整合到染色体dna。     目前正研制新一代组合载体可克服上述不足，该载体是来自不同病毒成份及特性组合体 。woo用逆转录病毒将胰岛素原基因导入大鼠肝脏，在病毒末端长重复序列的调控下，至少% ～ %肝细胞被转染，持续达6个月。若用stz处理大鼠，6天后均死于酸中毒，而在转导 周后 在用stz处理转基因大鼠，部分大鼠存活长达 周，但血糖水平类似于对对照鼠。提示来自于肝 细胞表达的胰岛素原的活性可以防止肝糖原大量减少，脂肪蓄积及酮体产生，但其转染效率尚 不能使血糖正常[ 9]。 
     . 胰导素原加工的改进     
    正常时胰岛素在β细胞分泌颗粒内加工为成熟胰岛素需要激素原转换酶pc 、pc 。但肝 细胞不能有效地加工胰岛素原，故产生的胰岛素原的生物活性较胰岛素低。另有一种富含于肝 细胞的成对碱性氨基酸蛋白酶（亦称泛转换酶或费林蛋白酶，furin），仅能识别鼠类胰岛素 原的arg-x-lys-arg序列，不能有效加工导入的人胰岛素原。为此，将furin序列引入人胰岛素 原cdna的g-c、c-a结合点，再导入肝细胞即可分泌成熟胰岛素[ 0]。因而，有学者将含有fur in识别序列的人胰岛素原载体转基因到小鼠肝脏，经高效液相色谱（hplc）分析显示胰岛素原 能有效地加工成胰岛素分子[ ]。 
     转化效率     
    首先，page通过改进培养条件或加入肝细胞生长因子（hgf）能使80%小鼠肝细胞及 0%人 肝细胞被转导[ ]。其次，亦可改进载体本身，一种组合病毒颗粒含有慢病毒（lentivirus, hiv )可将前病毒基因组整合到非分裂期细胞内，高滴度制备逆转录病毒载体，利用vsv包被蛋 白作为病毒壳蛋白替代env基因产物，可转导静止期肝细胞β，极有可能成为ⅰ型糖尿病基因 治疗的载体。 
    6 结语     
    综上所述，要取代ⅰ型糖尿病的注射胰岛素治疗，移植能分泌具有生物活性胰岛素的细 胞将是未来主要方向。然而，对细胞作基因工程以建立一种新型“β细胞”较为复杂，要作为 临床治疗手段，尚需进行许多改进得到更多的临床验证，此外，用细胞因子预防ⅰ型糖尿病或 血管并发症的临床价值尚待探索。在此崭新领域内治疗糖尿病可靠方法能否脱颖而出，取决其 疗效、安全、方便及费用。