FGFR3真核表达载体的构建及其在人白血病细胞系K562中的表达

　　近日，吉林大学基础医学院生物化学教研室研究人员发表论文，旨在构建成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）真核表达载体MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/purofgfr3-DN，并检测FGFR3蛋白在人白血病细胞系K562中的表达。研究指出，成功构建高表达野生型和突变型FGFR3的人白血病细胞系K562。该文发表在2014年第03期《吉林大学学报(医学版)》杂志上。

　　通过PCR法获得FGFR3全长基因（fgfr3-WT）和截短失活型的FGFR3（fgfr3-DN），经双酶切后与真核表达载体MSCV/puro连接，构建MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组表达质粒。经PCR、双酶切及测序鉴定正确后，脂质体介导转染至人白血病细胞系K562中，经puromycin抗性筛选后，Western blotting法和流式细胞术检测细胞中FGFR3蛋白的表达。

　　PCR法鉴定MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组质粒，2个质粒分别扩增出2 400bp的fgfr3-WT全长基因片段和1 200bp的fgfr3-DN截短型片段，表明成功扩增fgfr3-WT全长基因和1 200bp的fgfr3-DN基因；双酶切MSCV/puro-fgfr3-WT重组质粒，获得2 400bp的目的基因片段；测序显示，fgfr3-WT片段大小为2 400bp，Blast对比分析表明测序结果与GenBank中的FGFR3序列完全一致。fgfr3-DN片段大小与预先设计的序列完全一致，表明成功构建野生型FGFR3和突变失活型FGFR3真核表达载体；Western blotting检测，与对照组（K562-MSCV）比较，MSCV/puro-fgfr3-WT转染组（K562-WT）FGFR3蛋白表达水平增加，表达水平是对照组的10倍以上；MSCV/puro-fgfr3-DN转染组（K562-DN）的截短型的FGFR3（K562-DN）高表达，而对照组和K562-WT转染组则无此片段；流式细胞术检测，K562-WT组有57.5%的细胞高表达FGFR3，K562-DN组有41.5%的细胞高表达FGFR3-DN。