Cdc2/cdk1和survivin特异性siRNA真核表达载体的设计、构建和鉴定

　　近期，武汉大学基础医学院人体解剖学与组织学胚胎学系研究人员发表论文，旨在构建表达靶向cdc2/cdk mRNA和survivin mRNA的siRNA真核表达质粒。研究指出，本实验构建了靶向Cdc2/cdk1mRNA和survivin mRNA的真核表达质粒。重组质粒能有效转染人鼻咽癌细胞，phU6-cdc2/cdk1-shRNA2和phU6-survivin-shRNA2与phU6-cdc2/cdk1-shRNA1和phU6-survivin-shRNA1相比，转染CNE2 48h后其对相应蛋白的干扰率相对较高。该文发表在2015年第03期《海南医学院学报》杂志上。

　　从GenBank中搜索Cdc2/cdk1和survivin基因组标准序列，根椐siRNA设计原理构建siRNA真核表达质粒phU6-cdc2/cdk1-shRNA1、phU6-cdc2/cdk1-shRNA2、phU6-survivin-shRNA1和phU6-survivinshRNA。phU6-survivin-shRNA1、phU6-survivin-shRNA2、pU6-HK-shRNA质粒均含有增强绿色荧光基因作为报告基因和酶切位点，而phU6-cdc2/cdk1-shRNA1、phU6-cdc2/cdk1-shRNA2均含有红色荧光基因作为报告基因和酶切位点。质粒酶切、电泳、测序鉴定；用脂质体转染鼻咽癌CNE2细胞，荧光显微镜下观察、摄片、计数阳性细胞，计算转染效率，激光共聚焦显微镜检测质粒载体绿色和红色荧光蛋白的表达，免疫印迹法检测真核表达质粒对相应蛋白的抑制率。

　　荧光显微镜下计算转染效率显示在转染鼻咽癌细胞CNE2 48h转染率高达45.00%～57.45%；质粒phU6-cdc2/cdk1-shRNA1、phU6-cdc2/cdk1-shRNA2、phU6-survivin-shRNA1、phU6-survivin-shRNA2和pU6-HK-shRNA酶切后均可见400bp条带，与预期插入的目的基因大小一致，基因测序证实碱基序列与模板序列相符；在共聚焦显微镜下观察均见大量的细胞表达相应荧光；免疫印迹检测phU6-cdc2/cdk1-shRNA1、phU6-cdc2/cdk1-shRNA2、phU6-survivin-shRNA1和phU6-survivin-shRNA2对鼻咽癌CNE2细胞相应蛋白抑制率分别是33.00±1.41、38.31±1.01（survivin）、36.33±1.21和43.26±1.02（cdk1）。